null Análisis del interés clínico de la expresión de metaloproteasas y sus inhibidores naturales en el cáncer de mama con ganglios negativos
Reseñas de Investigación
05/09/2006

Francisco J. Vizoso1, L.O. González1, Mª Daniela Corte1, Juan Carlos Rodríguez1, Julio Vázquez1, Mª Luz Lamelas1, S. Junquera1, A.Martínez-Merino2, J.L. García-Muñiz3.

1 Hospital de Jove. Gijón, 2 Hospital de Cabueñes. Gijón, 3 Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo

Este trabajo ha sido financiado por el Instituto Carlos III (FIS) (EXPTE: PI04137)
El cáncer de mama representa el tumor maligno que más frecuentemente afecta a las mujeres. Además, a pesar del incremento de su incidencia, la mortalidad que genera no ha disminuido como era de esperar. Los objetivos de este trabajo han sido: evaluar la expresión morfológica de distintas metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs) y sus inhibidores naturales (TIMPs) en carcinomas invasivos primarios de mama; analizar la validación de la técnica de "tissue array" para la evaluación de la expresión de las MMPs y TIMPs; investigar la posible relación entre la expresión de esas proteínas y la recurrencia tumoral, expresada como el desarrollo de metástasis a distancia. rnLos resultados ilustran la importancia de integrar aspectos biológicos de la invasión tumoral y las metástasis en el contexto morfológico de los tumores en estadío temprano. Esto nos permite definir fenotipos tumorales de una mayor agresividad biológica, logrando así una gran precisión pronóstica que nos posibilita seleccionar pacientes de cara a tratamientos individualizadamente más adecuados, así como establecer nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de mama.
Introducción

El cáncer de mama representa el tumor maligno que más frecuentemente afecta a las mujeres. Además, a pesar del incremento de su incidencia, la mortalidad que genera no ha disminuido como era de esperar. Esto es debido al hecho de que aunque menos del 10% de las mujeres con cáncer primario de mama tienen signos clínico-patológicos de enfermedad diseminada en el momento de su diagnóstico inicial, ocurre recurrencia tumoral en forma de metástasis en cerca de la mitad de los casos con tumores aparentemente localizados entre los cinco años siguientes a la cirugía. Sin embargo, aun a pesar de la consideración de los factores pronósticos clásicos (estadío, grado histológico y receptores hormonales), resulta difícil predecir en qué pacientes se desarrollarán metástasis a distancia. Esto es a causa de que el cáncer de mama es una enfermedad heterogénea, abarcando una variedad de entidades patológicas y una amplia variabilidad de su comportamiento clínico. Por tanto, deben de ser identificados nuevos factores pronósticos de cara a mejorar la actual clasificación de riesgo, y así poder desarrollar un tratamiento más racional de las pacientes con cáncer de mama.

El desarrollo de la invasión tumoral y de las metástasis son determinantes principales del pronóstico de las pacientes y, por tanto, la moléculas involucradas en esos procesos son obvias candidatas a ser consideradas como nuevos marcadores pronósticos en el cáncer de mama. La degradación de la matriz extracelular y de los componentes de la membrana basal son pasos decisivos en la invasión tumoral y metástasis, y los enzimas proteolíticos de varias clases son los que ejecutan esas acciones. Sin embargo, algunos componentes, particularmente los colágenos intersticiales, son muy resistentes al ataque proteolítico, siendo tan solo degradadas por las metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs). En la actualidad se han identificado 28 miembros de la familia de MMPs humanas, que pueden ser clasificadas en base a su especificidad de sustrato y estructura primaria, en el subgrupo de colagenasas (MMP-1, -8 y -13),  estromalisinas (MMP-3, -10, -11), MMPs asociadas a membrana (MMP-14, -15, -16, -17, -23, -24, -25) y otras nuevas MMPs. Las MMPs son sintetizadas como cimógenos inactivos, que son luego activados predominantemente en situación pericelular por otras MMPs o serín-proteasas. La actividad de las MMPs es específicamente inhibida por sus inhibidores naturales (TIMPs) o por inhibidores no específicos (por ejemplo, a2-macroglogulin). Hasta la fecha se conocen cuatro diferentes TIMPs (TIMPs 1, 2, 3 y 4).  El balance entre MMPs y sus inhibidores resulta esencial en muchas situaciones fisiológicas donde es requerida una rápida remodelación de la matriz extracelular, siendo alterado en algunas condiciones patológicas, como el cáncer. Además, hoy se conocen datos que hacen cambiar el clásico dogma establecido de que las MMPs promueven las metástasis exclusivamente mediante la modulación  de la remodelación de la matriz extracelular. Las MMPs pueden influir en el comportamiento mismo de la célula tumoral como consecuencia de su capacidad de activar factores de crecimiento, receptores de la superficie celular, moléculas de adhesión celular o moléculas angiogénicas. Por el contrario, las MMPs pueden actuar inactivando inhibidores de la angiogénesis o sustancias pro-apoptósicas, conduciendo esto último a la evasión de la muerte celular programada por parte de las células cancerosas. De acuerdo con esas observaciones de índole experimental, recientes estudios describen que la expresión tumoral de diversas MMPs, en particular las gelatinasas MMP-2 y MMP-9, se asocian con un peor pronóstico en algunos subgrupos de pacientes con cáncer de mama. No obstante, se ha sugerido que la coexpresión de diferentes MMPs y TIMPs podría aportar una mayor precisión pronóstica en el cáncer de mama. Además, existen otros dos elementos de complejidad relacionados con el papel de las MMPs y TIMPs en el cáncer de mama. Por una parte, deberíamos considerar que el tipo celular (célula tumoral/célula estromal) que expresa cada factor podría resultar de importancia biológica en la progresión tumoral. Así, por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de MMP-13 (colagenasa-3) por los miofibroblastos peritumorales está asociado con el componente microinvasivo de los carcinomas in situ de mama. Por otra parte, otros estudios demuestran que los TIMPs son moléculas multipotenciales, cuyo papel no solo se limita a una inhibición enzimática de las MMPs, sinó que también están involucradas en aspectos que, por el contrario, pueden favorecer la progresión tumoral, tales como la inducción de la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis.

Todos esos datos sugieren la importancia de conocer en más detalle los aspectos relacionados con la expresión de MMPs y TIMPs en el cáncer de mama. Por tanto, la consideración de nuevas técnicas que nos permitan evaluar una amplia variedad de proteínas, así como el tipo celular que las expresa en el escenario tumoral, pueden contribuir a un mejor entendimiento de la compleja biología molecular del cáncer de mama y a una evaluación pronóstica más precisa. La técnica inmunohistoquímica aplicada sobre mallas de tejido ("tissue microarrays") (TMAs) supone una plataforma potencialmente eficiente de cara a evaluar la expresión de muchos factores en una amplia muestra de pacientes, mediante una limitada cantidad de reactivos, y en un corto tiempo de análisis. TMA es una técnica puramente mecánica que implica la toma de cilindros de tejido de múltiples bloques "donadores", y una posterior inserción precisa dentro de un bloque "receptor" previamente vacío, donde las muestras tumorales quedan dispuestas alineadas y perfectamente identificables. Este método, aplicado sobre muestras embebidas en parafina, puede permitirnos una adecuada caracterización de los tumores, ya que también nos posibilita la evaluación del tipo celular que expresa el correspondiente factor biológico en el escenario tumoral.

Objetivos

Los objetivos de este trabajo han sido:

  • Evaluar la expresión morfológica de distintas MMPs y TIMPs en carcinomas invasivos primarios de mama, que han sido descritas como de importancia biológica o clínica en el cáncer de mama.
  • Analizar la validación de la técnica de "tissue array" para la evaluación de la expresión de MMPs y TIMPs.
  • Investigar la posible relación entre la expresión de esas proteínas y la recurrencia tumoral, expresada como el desarrollo de metástasis a distancia.
Metodología

Se seleccionaron 62 mujeres, sin metástasis a distancia en el momento del diagnóstico inicial, que se sometieron a intervención quirúrgica por carcinoma ductal infiltrante de mama y ganglios negativos, entre 1990 y 2002. De ellas, 28 desarrollaron metástasis a distancia durante el periodo de seguimiento clínico, mientras que las otras 34 no desarrollaron recurrencia tumoral durante un periodo mínimo de seguimiento de 5 años. El porcentaje de casos con diferentes tamaños tumorales, grados histológicos y estado de los receptores de estrógenos y de progesterona de los tumores, fue similar entre los dos grupos. Asimismo, no existieron diferencias significativas entre los dos grupos en cuanto al tratamiento quirúrgico o adyuvante recibido. Se elaboraron dos bloques de TMAs y se determinaron, en secciones titulares de los mismos de 5-µm, diferentes MMPs y TIMPs mediante análisis inmunohistoquímico. Para ello se utilizaron anticuerpos específicos contra cada proteína, y un inmunoteñidor automático (Dako). El resultado de las tinciones se evaluó mediante el apoyo de un sistema de análisis de imagen con un microscopio CAS 200 y un programa informático (analySIS®). Se evaluó la expresión global de cada MMP o TIMP aplicando la fórmula SCORE: Intensidad de tinción (de 1 a 3) X porcentaje de células teñidas. Además, se evaluó la expresión de cada factor tanto en la célula tumoral como en las del estroma intratumoral (fibroblastos y células inflamatorias monocitarias). En 10 casos, de designación aleatoria, se compararon los valores de SCORE obtenidos en los TMAs con los correspondientes al conjunto de las secciones tisulares. La correlación entre los valores de tinción inmunohistoquímica en las secciones tisulares de los TMAs y del conjunto de los bloques tumorales originales, se evaluó mediante el test de Spearman. Las curvas de supervivencia libre de enfermedad se calcularon mediante el método de Kaplan-Meier, y se compararon con el test de log rank.

Resultados

La Figura 1 muestra ejemplos de tinciones inmunohistoquímicas para las proteínas sobre las mallas de tejido.


Figura1. Tinciones inmunohistoquímicas positivas para MMP-11y MMP-14 en carcinomas mamarios. Magnificación X200.

 


En la Tabla 1 se puede apreciar la  amplia variabilidad de los valores de tinción inmunohistoquímica (SCORE) para cada proteína.  El análisis de validación entre el resultado de las tinciones en los discos obtenidos de los TMAs y en el conjunto de las secciones tisulares de los tumores, mostraros una altísima correlación significativa y positiva (r>0,9 y p <0,01, para todas las proteínas). Por otra parte, encontramos asociaciones significativas entre las expresiones de muchos de los factores analizados y la ocurrencia de metástasis a distancia. Así, las pacientes con expresiones tumorales elevadas (valores de SCORE>valor de mediada para cada proteína) de MMP-9, MMP-11, MMP-14, TIMP-1 y TIMP-2, se asociaron con una menor supervivencia libre de metástasis a distancia (p=0,01; para todos los casos). Asimismo, la consideración del  tipo celular que mostró expresión de los factores, contribuyó a una mayor precisión pronóstica. Tal fue el caso de la expresión de la MMP-11 (p <0,0001) o de la MMP14 (p<0,0001) por las células inflamatorias mononucleares, o la expresión del TIMP-2 por las células fibroblásticas del estroma intratumoral (p<0,0001).

 

Tabla 1. Expresión de MMPs y TIMPs en 62 carcinomas mamarios
invasivos con ganglios negativos
Abreviaturas: I, intensidad de tinción,; PC, porcentaje de células teñidas;CT,
célula tumoral; F, fibroblastos; CIM, células inflamatorias mononucleares

La figura 2 muestra las curvas de supervivencia determinadas para las pacientes en función de la expresión de esas proteínas cuyos resultados resultaron de mayor potencia pronóstica.


Figura 2. Curvas de tiempo libre de metástasis a distancia en 62 pacientes con carcinoma de mama y ganglios negativos en función de: tinción en células inflamatorias monocitarias para MMP-14, y tinción en fibroblastos para MMP-11


 
Discusión

Nuestros resultados muestran una heterogeneidad biológica de los carcinomas mamarios con ganglios negativos, en cuanto a la expresión de proteínas implicadas en la invasión tumoral y metástasis, tanto en relación con la expresión global de las mismas como con el tipo celular responsable de la expresión (célula tumoral/células del estroma intratumoral). Además, nuestros resultados muestran la validación de la técnica de los TMAs para la evaluación de la expresión de MMPs y TIMPs con el análisis inmunohistoquímico, así como de cara a la predicción del desarrollo de metástasis a distancia.  La expresión de MMPs está asociada con la ocurrencia de metástasis a distancia. Asimismo, la expresión de los TIMPs también se asocia con una mayor agresividad tumoral, probablemente debido a la multipotencialidad de esas proteínas que también incluye la estimulación de la celular tumoral. Nuestros resultados también sugieren un papel importante de las células no cancerosas del estroma del tumor primario (como fibroblastos y células inflamatorias mononucleares), que mediante la producción de factores como MMP-11, MMP-14 y TIMP-2, parecen facilitar  el desarrollo de metástasis. En definitiva nuestros resultados ilustran la importancia de integrar aspectos biológicos de la invasión tumoral y las metástasis en el contexto morfológico de los tumores en estadío temprano. Esto nos permite definir fenotipos tumorales de una mayor agresividad biológica, logrando así una gran precisión pronóstica que nos posibilita seleccionar pacientes de cara a tratamientos individualizadamente más adecuados, así como establecer nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de mama.

Palabras clave: cáncer de mama metaloproteasas inhibidores naturales ganglios negativos

Bibliografía

Liotta LA, Tryggvason K, Garbisa S, Hart I, Foltz CM, Shafie S. Metastatic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collagen. Nature 1980;  284:  67-68.

Nielsen BS, Rank F, López JM, Balbín M, Vizoso F, Lund LR. Collagenase-3 expression in breast myofibroblasts as a molecular marker of transition of ductal carcinoma in situ lesions to invasive ductal carcinomas. Cancer Res 2001; 61: 7091-7100.

Lopez-Otin C, Overall CM. Protease degradomics: a new challenge for proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3: 509-519.

Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer 2002; 2: 161-174.

Jones JL, Glynn P, Walker RA. Expression of MMP-2 and MMP-9, their inhibitors, and the activator MT1-MMP in primary breast carcinomas. J Pathol 1999; 189: 161-168.

Autores:

Francisco J. Vizoso1, L.O. González1, Mª Daniela Corte1, Juan Carlos Rodríguez1, Julio Vázquez1, Mª Luz Lamelas1, S. Junquera1, A.Martínez-Merino2, J.L. García-Muñiz3.

Número: 5 de 2006