null Desarrollo de modelos murinos con líneas celulares de carcinomas nasosinusales
Reseñas de Investigación
11/09/2015

María Costales Marcos, César Alvarez Marcos, Mario Hermsen

Fernando López Alvarez y José Luis Llorente Pendás

Servicio de ORL. Hospital Universitario Central de Asturias. Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias

PI 11/00929 y PI081599

Los tumores malignos nasosinusales son agresivos y con baja supervivencia. rnEn el estudio del cáncer se han desarrollado líneas celulares y modelos animales, pero hay pocos estudios en tumores nasosinusales.rnSe trata de desarrollar modelos (xenoinjertos subcutáneo y ortotópico) en ratones con líneas celulares, describiendo su patrón genético.rnMaterial y método: línea IAC-3 (adenocarcinoma) y NC-4 (carcinoma escamoso). Ratones nude. Inmunohistoquímica y estudio genético (mCGH y MLPA). rnResultados: se desarrolló el modelo subcutáneo y ortotópico con NC4, pero no con ITAC-3. Se observa un perfil genético similar entre la línea y el tumor murino.rn

Introducción

Los tumores malignos originados en las fosas nasales (FN) y senos paranasales (SP) tienen características propias que los diferencian del resto de neoplasias de la vía aerodigestiva superior (VAS)1. Su baja incidencia y alta diversidad histológica son un obstáculo para su estudio, al no haber centros que concentren series amplias y experiencia suficiente para establecer protocolos terapéuticos consensuados. Los tipos histopatológicos más frecuentes son los carcinomas, entre los que destacan los adenocarcinomas nasosinusales (ACNS), concretamente la variedad tipo intestinal (ITAC), y los carcinomas escamosos nasosinusales (CENS). Ambas estirpes histopatológicas difieren de otros tumores malignos de la VAS en que su etiología no se relaciona de manera directa con el tabaco y alcohol, aunque sí con algunas actividades profesionales como son las relacionadas con la industria de la madera (ebanistas, carpinteros...).

Aunque la histopatología de ACNS y CENS es distinta, comparten similitudes como su origen anatómico y comportamiento clínico. En la última década se ha avanzado mucho en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos, no obstante la supervivencia no ha experimentado cambios sustanciales. Esta circunstancia obliga a buscar nuevas estrategias de diagnóstico precoz por medio de la biología molecular, además de nuevos agentes antitumorales contra dianas moleculares específicas de estos tumores.

En los últimos años se han desarrollado modelos funcionales, in vitro, con líneas celulares e in vivo, con modelos animales, con aplicación al estudio del cáncer y al desarrollo de nuevas terapias.

Nuestro grupo ha establecido líneas celulares de ACNS2 y CENS, además de haber realizado estudios en modelos animales con líneas celulares de carcinoma escamoso de cabeza y cuello (CECC).

Los modelos funcionales, tanto in vitro como in vivo, han sido utilizados para estudiar la eficacia de diversos agentes terapéuticos que frenan el crecimiento tumoral3. Los modelos animales tendrían mayor fiabilidad biológica que las líneas celulares siendo su desarrollo específico en cada tumor, un paso necesario para introducir nuevos fármacos en la terapia de estos pacientes.

El objetivo de este estudio fue diseñar y realizar un modelo murino xenoinjerto ortotópico implantando en las fosas nasales y senos paranasales las líneas celulares tumorales procedentes de un ITAC y de un CENS (ITAC-3 y NC-4, respectivamente).

Metodología

Para realizar este estudio utilizamos 2 líneas celulares, una procedente de un ACNS, denominada ITAC-3 y otra, procedente de un CENS, denominada NC-4.

Asimismo, utilizamos ratones nude macho de 5 semanas, que se mantuvieron y controlaron en el Bioterio de la Universidad de Oviedo, cumpliendo los criterios del protocolo de bienestar animal. Los procedimientos empleados fueron aprobados por el Comité de ética del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA). Los animales inmunodeprimidos (nude) se mantuvieron siempre en un microambiente libre de patógenos. Se emplearon jaulas estériles equipadas con filtros de aire HEAPA, dispuestas en una unidad especial de aislamiento. Los animales se alimentaron con pienso irradiado (Panlab) y agua autoclavada, a la que se añadía tetraciclina al 0,1%. Los animales se manejaron en todo momento bajo condiciones de rigurosa asepsia.

Para realizar el modelo ortotópico, los animales se anestesiaron con una combinación de Clorhidrato de Ketamina (Imalgene® 500 mg, 75 mg/Kg) y Medetomidina (Domtor®, 0,5 mg/Kg), mediante inyección intraperitoneal.

Utilizamos una jeringa de insulina de 1 ml y una aguja de 30 G. Tras esperar unos minutos, una vez dormidos los animales, se introdujo la aguja por la fosa nasal, ligeramente inclinada hacia abajo y hacia la pared lateral hasta que tocamos hueso. La suspensión celular se introdujo lentamente desde la jeringa de insulina, colocando a los animales en la jaula con la cabeza inclinada hacia arriba. El número de células empleadas, el número de animales y el momento del sacrificio queda reflejado en la tabla 1.

Tabla 1. Experimentos realizados: número de ratones, número de células y semana de sacrificio

Línea celular

Número ratones

Nº Células

Semana sacrificio

NC-4

5

150.000

15

NC-4

10

2.000.000

8-12

NC-4

5

3.000.000

9-22

ITAC-3

5

150.000

16

ITAC-3

5

2.000.000

27

Los animales se sacrificaron introduciéndolos en una cámara cerrada de CO2. Se sacrificaron cuando se observó crecimiento tumoral macroscópico en el dorso nasal o en la región del seno maxilar o al apreciar un deterioro del estado general de los ratones. Una vez sacrificados, se seccionaron las cabezas mediante una guillotina específica y se introdujeron en EDTA para decalcificarlas. Las muestras se fijaron en formol durante 24 horas. Se incluyeron en bloques de parafina para, posteriormente, realizar cortes de 4 μm, tiñéndose con hematoxilina-eosina.

Para el estudio genético utilizamos el ADN procedente del tumor primario, las células cultivadas in vitro y los tumores murinos. Una vez extraído el ADN se estudia por medio de m-CGH y MLPA, con el fin de establecer similitudes y diferencias en el perfil génico de los distintos tejidos originados de la misma estirpe celular.

Resultados

Los resultados obtenidos con la línea NC-4 fueron positivos para el desarrollo de tumores macroscópicos en 7 de los 20 ratones utilizados (Figura 1). El estudio histopatológico se correspondió en todos los casos con el aspecto macroscópico, es decir, todos los animales con tumor macroscópico lo tenían en la histopatología. El estudio histopatológico reveló un carcinoma escamoso poco diferenciado con crecimiento sólido. Las células neoplásicas mostraron pleomorfismo nuclear, nucleolo prominente y citoplasma acidófilo. Se observó diferenciación escamosa y necrosis. El número de mitosis atípicas por campo fue variable, pero superior a 7. En el interior del tumor se observaron restos  de trabéculas de hueso por la infiltración ósea. En algunos ratones el tumor se situó en la cavidad etmoidal y mostró un crecimiento exofítico hacia la cara anterior y superior. En otros, el tumor se situó por encima del paladar. Los cortes histopatológicos de los tumores se ilustran en la Figura 2.

Figura 1. Desarrollo de tumores nasales con la línea NC-4. Tumor en dorso nasal

Figura 2. Corte histopatológico de tumor desarrollado en cavidad etmoidal en ratón

Los resultados obtenidos con la línea ITAC-3 fueron negativos en todos los animales empleados. Es decir, no se observó desarrollo de tumores maroscópicos en ninguno de los animales utilizados. El estudio histopatológico de las cabezas procesadas no mostró presencia de lesión neoplásica microscópica a ningún nivel.

Las alteraciones génicas observadas con MLPA en el CENS origen, la línea celular NC-4 y en el ADN de los tumores desarrollados en los ratones son similares, mostrando un mismo perfil en las tres muestras, si bien las alteraciones génicas (ganancias y pérdidas) son más exacerbadas en la línea celular y en los tumores murinos que en el tumor primario. Al utilizar la técnica de microarrays-CGH en las mismas muestras se observó el mismo patrón de alteraciones en las 3 muestras, también más marcadas en la línea celular y en el ADN de los tumores murinos.

En el caso del ITAC, solamente se pudieron comparar las alteraciones observadas en el tumor primario y en la línea ITAC-3, ya que no se desarrollaron tumores murinos de los que obtener ADN. El perfil de alteraciones observado mediante ambas técnicas (MLPA y m-CGH) fue similar, sin observarse diferencias significativas.

Discusión

Los carcinomas nasosinusales, entre los que se incluyen los ACNS y los CENS, son tumores malignos con una incidencia muy baja, relacionada con el área geográfica y la exposición ambiental2,4. Así, las series publicadas son limitadas en número y, por tanto, poco adecuadas para realizar en ellas ensayos clínicos de trascendencia y, menos aún, diseñar protocolos terapéuticos.

Existen muy pocos estudios publicados sobre los modelos funcionales in vitro o in vivo en la localización nasosinusal. Conocer el comportamiento tumoral con modelos animales nos permitiría determinar los cambios histopatológicos y moleculares que tienen lugar durante la carcinogénesis en la FN y SP. Además, estos modelos podrían ser de gran interés en el estudio de las fases de la progresión tumoral y, por tanto, con aplicación clínica en la prevención, diagnóstico precoz y terapéutica.

Los avances en tecnología molecular de los últimos años han permitido la secuenciación del genoma tumoral y conocer muchas de las alteraciones que presentan los distintos tipos tumorales. Sin embargo, un problema actual en la asistencia clínica es la falta de marcadores de respuesta o resistencia de un determinado tumor a los agentes terapéuticos.

Por otra parte, nuestro trabajo se justifica porque los resultados con los modelos funcionales podrían ser aplicables en la metodología de estudio en otros tumores más frecuentes, histológicamente similares, pero con localizaciones distintas como el resto de tumores de las VAS, pulmón, esófago, colon y estómago.

En los modelos animales hemos usado como herramienta básica para el desarrollo de tumores inducidos a la línea celular ITAC-3 y a la línea NC-4. Ambas líneas celulares han sido obtenidas en el laboratorio a partir de pacientes intervenidos de esos tumores en nuestro departamento clínico. Las líneas muestran características genotípicas similares a las de los tumores origen, hecho que es destacado por la literatura como una condición necesaria para realizar estudios traslacionales en pacientes.

Ambas líneas han sido estudiadas genéticamente y comparadas con el ADN del tumor primario del que proceden con el fin de validarlas. En los dos casos y en las dos técnicas empleadas (MLPA y m-CGH) se observa que las líneas comparten el mismo patrón de alteraciones que el tumor primario, por lo que podemos afirmar que son herramientas útiles para el estudio de ambos tumores.

Respecto al modelo animal ortotópico, se obtuvo un resultado positivo con la línea NC-4 en 7 de los 20 ratones empleados (35%). Los estudios referidos hasta ahora a modelos animales en cabeza y cuello han sido realizados en la lengua o en el suelo de la boca, donde inyectar un volumen alto de células resulta más sencillo. Nuestro modelo ortotópico en FN y SP es el primero realizado con células procedentes de un CENS e implantadas a nivel de FN y SP en el animal5,6. El patrón de invasión histopatológico de los tumores desarrollados en los ratones mostró un crecimiento exofítico, hacia la superficie, sin invadir, en ningún caso la órbita o el cerebro. Esto difiere de lo observado en humanos donde los CENS tienen un comportamiento distinto, al invadir, con frecuencia, la órbita y el cerebro durante su progresión (en humanos la invasión cerebral se observa en un 30% de los casos). Una línea de investigación futura podría estudiar los enzimas proteolíticos implicados en la progresión tumoral y determinar su expresión en los tumores murinos y humanos, con el fin de demostrar diferencias que determinen su patrón de invasión.

Con la línea ITAC-3 no obtuvimos resultados positivos en ningún caso, lo que demuestra que esta línea celular no tiene capacidad para crecer in vivo. Los resultados concuerdan con lo observado en la literatura, ya que no se ha descrito un modelo animal para los ACNS. Una posible explicación podría ser las características intrínsecas del tumor, que, por su lento crecimiento, tarda años en desarrollarse en el paciente. Además, los animales inmunodeprimidos carecen de respuestas inflamatorias, que podrían actuar como cofactor en el desarrollo de este tipo de tumores.

El análisis genético con MLPA y m-CGH demuestra y valida a las líneas como herramientas específicas y útiles de ambos tipos de tumores, ya que presenta, de manera general, las mismas alteraciones génicas que los tumores primarios de los que proceden. La caracterización genética del CENS origen, la línea celular NC-4 y los tumores murinos inducidos es similar, indicando la conservación del patrón genético entre el tumor origen y la línea celular, manteniendo la pureza de la línea en los tumores inducidos, confirmando la validez de los modelos in vitro e in vivo.

Con este trabajo se abre una línea de investigación para seguir profundizando en el conocimiento sobre los tumores nasosinusales. Consideramos, que el diseño y perfeccionamiento de los modelos funcionales específicos puede contribuir al conocimiento y manejo terapéutico de los tumores nasosinusales. Los resultados obtenidos, convenientemente validados, podrían servir para un tratamiento más racional y eficaz de los pacientes.

Palabras clave:

Bibliografía

1Llorente JL, Pérez-Escuredo J, Alvarez-Marcos C, Suárez C, Hermsen M. Genetic and clinical aspects of wood dust related intestinal-type sinonasal adenocarcinoma: a review. Eur Arch Otorhinolaryngol 2009;266:1-7. 

2Pérez-Escuredo J, García Martínez J, García-Inclán C, Vivanco B, Costales M, Álvarez Marcos C, Llorente JL, Hermsen MA. Establishment and genetic characterization of an inmortal tumor cell line derived from intestinal-type sinonasal adenocarcinoma. Cell Oncol 2011;34:23-31. 

3Dietz A, Boehm A, Horn IS, Kruber P, Bechmann I, Golusinski W, Niederwieser D, Dollner R, Remmerbach TW, Wittekind C, Dietzsch S, Hildebrandt G, Wichmann G. Assay-based response evaluation in head and neck oncology: requirements for better decision making. Eur Arch Otorhinolaryngol 2010;267:483-494. 

4López F, Llorente JL, Oviedo CM, Vivanco B, Marcos CÁ, García-Inclán C, Scola B, Hermsen MA. Gene amplification and protein overexpression of EGFR and ERBB2 in sinonasal squamous cell carcinoma. Cancer 2012;118:1818-1826 . 

5Gelbard A, Kupferman ME, Jasser SA, Chen W, El-Naggar AK, Myers JN, Hanna EY. An orthotopic murine model of sinonasal malignancy. Clin Cancer Res 2008;14:7348-7357. 

6Helman EE, Newman JR, Dean NR, Zhang W, Zinn KR, Rosenthal EL. Optical imaging predicts tumor response to anti-EGFR therapy. Cancer Biol Ther 2010;10:166-171. 

Autores:

María Costales Marcos, César Alvarez Marcos, Mario Hermsen

Fernando López Alvarez y José Luis Llorente Pendás

Número: 35 de 2015