null Expresión de antígenos de histocompatibilidad en células embrionarias humanas. Dianas epigenéticas y potencial uso terapéutico
Reseñas de Investigación
05/09/2007

Carlos Lopez-Larrea, Miguel A. Blanco-Gelaz, Cristina Bravo Menéndez, Beatriz Suárez Álvarez.

Unidad de Histocompatibilidad y Transplante. HUCA, Oviedo.

inmuno@hca.es

FIS (PI051707). Investigador Principal: Carlos López-Larrea
A la vista de los estudios realizados podemos concluir que las células de la primera línea embrionaria de origen humano (hESC) muestran una baja expresión de las moléculas de la clase I del complejo mayor de hitocompatibilidad (MHC-I) en la superficie celular, así como la ausencia de algunas de las moléculas implicadas en la maquinaria de su procesamiento antigénico (TAP-1, TPN, Erp57). Otras moléculas implicadas en el plegamiento correcto de las glicoproteínas (CNX,CLR) muestran niveles normales de expresión. Estos resultados abren una vía de estudio centrada en la modificación epigenética de genes asociados al MHC-I en hESC con el objetivo de generar una linea hESC tolerogénica que podría ser donante universal.
Introducción

En 1998 Thomson et al. 1 describieron la generación de la primera linea embrionaria de origen humano (hESC) a partir de la masa interna (ICM) del embrión preimplantado en fase de blastocisto. Esto estableció un hito en las posibilidades futuras de la medicina regenerativa, abriendo grandes expectativas debido al enorme potencial que suponía usar estas células como fuente de generación de tejidos de diferentes estirpes celulares.

Las hESC se definen como células "blancas" capaces de diferenciarse a la mayoria de tipos celulares presentes en el individuo adulto (pluripotentes), además de dividirse y renovarse en cultivo durante largos periodos de tiempo. La forma en que se evalúa la pluripotencialidad de las hES consiste en la capacidad de estas células para formar cuerpos embrioides (EBs) en los cuales ya estan presentes células procedentes de las tres capas germinales, así como en la formación de teratomas en ratones inmunodeprimidos. Las hESC son por tanto una importante fuente de células  pluripotenciales que pueden ser utilizadas en el futuro en medicina regenerativa. El desarrollo de protocolos de diferenciación y obtención de estirpes celulares homogéneas es uno de los retos importantes para su posible uso en terapia celular.

Uno de los problemas principales en medicina del trasplante es el reconocimiento alogénico del injerto y la subsecuente  activación del sistema inmune que conduce al rechazo del órgano transplantado. Este reconocimiento va dirigido fundamentalmente a los antígenos de histocompatibilidad (sistema MHC) del donante.  El uso en medicina regenerativa de hESC y derivados plantea el mismo problema de aloantigenicidad.

Hasta la fecha existen pocos y contradictorios estudios en relación con la expresión de MHC en hES. Algunos señalan ausencia de expresión mientras que otros encontraron expresión de MHC-I al menos en alguno de los blastocitos examinados. Se conoce que las hESC expresan MHC-I aunque a nivel muy bajo, y estos niveles incrementan de 2-4 veces cuando se diferencian a EBs y de 8-10 veces en el estado diferenciado de teratomas. Sin embargo estos niveles son unas 10 veces menores que los detectados en cualquier célula somática. Además sólo IFN-γ es capaz de aumentar la expresión en células hES indiferenciadas y EBs, mientras que los tres IFNs aumentan la expresión de MHC-I en teratomas alcanzando niveles similares a los observados en células somáticas. Tanto MHC-II como HLA-G no se expresan aparentemente ni en hES indiferenciadas ni en EBs ,y su expresión no se ve aumentada por ningún IFNs. Todo ello indica que las hES podrían representar un tipo de célula con propiedades tolerogénicas, capaz de inhibir la respuesta local inmune.

No obstante, estos resultados parecen indicar que estas propiedades no se mantendrían después de la diferenciación específica de hES a determinadas estirpes celulares y que se comportarían como aloantigénicas en trasplante celular.  Se han propuesto varias estrategias para obviar el reconocimiento aloantigénico y que permitan el uso de hES en trasplante 2. Entre ellas cabe mencionar: a) que el transplante celular se realice en compartimentos considerados como inmunoprivilegiados; b) creación de un amplio banco de hES que contemple todas las posibilidades y combinaciones de MHC existentes en al población, c) generación de lineas isogénicas mediante técnicas de transferencia somática nuclear o el establecimiento de un banco de lineas derivadas de activación partenogenética de oocitos; d) inducción de toleración mediante quimerismo hematopoyético, mediante la infusión de APC del donante. Todas estas estrategias son excesivamente costosas y suponen un enorme esfuerzo colaborativo y tecnológico.

La creación de una linea(s) hESC que pueda ser tolerada por cualquier paciente, es uno de los objetivos fundamentales de la medicina regenerativa. Para la abolición de la expresión de MHC-I en hES, se pueden utilizar varias estrategias tales como eliminación de la expresión a través de genes como B2m y TAP implicadas en el procesamiento mediante técnicas de RNA de interferencia (RNAi) o recombinación homóloga. Una ventaja adicional de las hES  es la relativa facilidad por la cuál pueden ser genéticamente modificadas por una amplia diversidad de técnicas tales como transfección, electroporación e infecciones virales a diferencia de las células fetales u órganos, donde su manipulación es tecnológicamente muy compleja.

La metilación del DNA es esencial para el desarrollo normal de los mamíferos y la diferenciación celular 3. Las células madre embrionarias tienen patrones de metilación del ADN únicos y diferentes de los de células madre trofoblásticas, germinales y células adultas 4. Este mecanismo clave de la regulación epigenética provoca el silenciamiento de genes y formación de heterocromatina. Además de la metilación del ADN, la modificación de histonas juega un papel importante en la formación de la heterocromatina, reordenamiento cromosómico y regulación génica. La metilación de histonas es asociada directa e indirectamente con cambios en el perfil de metilación del ADN. En relación con las hESC, acetilación de histonas y la metilación del residuo lisina-4 de la histona H3 (H3-K4) afectan a la activación de genes por relajamiento de la cromatina mientras que por el contrario la metilación de la lisina 9 y 27 de la H3 (H3-K9 y H3-K27) es relacionada con el silenciamiento de genes por condensación de la cromatina 5.

Objetivos

Todos estos datos nos han llevado a :1) estudiar en el presente trabajo la expresión de MHC-I (clásico y no clásico) en la línea de hESC Shef-1, así como en EBs y células diferenciadas de las mismas. 2) Evaluar la expresión de las moléculas implicadas en la maquinaria de procesamiento antigénico (TAP-1, TPN, LMP2, LMP7, Erp57, CNX, CLR etc), 3) y análisis de los mecanismos epigenéticos que podrian regular su expresión. Estas moléculas son esenciales para que los antígenos de histocompatibilidad se expresen en la superficie celular.

Estos resultados nos permitiran conocer si las moléculas implicadas en la expresión del MHC-I podrian ser modificadas epigenéticamente con el objetivo de generar una linea hESC tolerogénica que podría ser donante universal.

Metodología

Cultivo hESC y diferenciación: La linea hESC Shef-1 fue derivada en el "Centre for Stem Cell Biology" (Sheffield, UK) y donada por el Dr. Harry Moore. Las hESC fueron cultivadas en medio ES (KnockOut DMEM suplementado con 20% KnockOut serum replacement, 2 mM L-Glutamina, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% aminoácidos no esenciales, 4 ng/ml factor básico de crecimiento de fibroblastos, bFGF) sobre fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con mitomicina C. Para la formación de cuerpos embrionarios (EBs), colonias de hESC fueron recuperadas del frasco de cultivo con colagenasa y posteriormente cultivadas en suspensión en medio ES sin bFGF. Los experimentos de diferenciación in vitro fueron hechos a partir de EBs cultivados tres semanas y posteriormente crecidos en monocapa en medio DMEM + 10% suero fetal bovino (FBS).

Los cultivos diferenciados se tiñeron con diversos anticuerpos para el estudio de la estirpe celular.

Técnicas de RT-PCR, Western-blot, Modificación de bisulfito e Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) fueron realizadas según protocolos estándar.

Resultados

En la figura 1 mostramos el proceso de diferenciación in vitro de la línea embrionaria humana Shef-1. Las hESC indiferenciadas fueron crecidas en suspensión en medios específicos para la obtención de EBs. Posteriormente, diferenciación espontánea fue llevada a cabo en medio con FBS (suero bovino fetal) en cultivos adherentes. Las células diferenciadas proceden de varias estirpes celulares como puede observarse por la tinción parcial con citoqueratinas indicando la presencia de células epiteliales.

 

Figura 1. Cultivo y diferenciación de la línea hESC Shef-1, (A) células indiferenciadas en cultivo
sobre fibroblastos embrionarios de ratón inactivados, (B) cuerpos embrioides (EBs) en cultivos
en suspensión crecidos durante 3 semanas, (C) células diferenciadas de forma espontánea in
vitro y teñidas con un anticuerpo anti-citoqueratinas.


La expresión tanto a nivel de mRNA como de proteína del MHC-I y de las moléculas implicadas en el procesamiento antigénico puede ser observada en la figura 2. La línea hESC Shef-1 expresa niveles muy bajos de MHC-I respecto a la expresión en linfocitos periféricos (PBLs) y en comparación con líneas linfoblastoides deficientes o con baja expresión de MHC-I (221, C1R). CNX (Calnexina) y CRL (Calreticulina), chaperones lectina implicados en el plegamiento de glicoproteínas sintetizadas de nuevo en el retículo endoplasmático (RE), son expresados en hESC aunque a niveles inferiores. Por el contrario, nosotros observamos ausencia de expresión de TAP-1 (Transportador Asociado con el Procesamiento antigénico), TPN (Tapasina) y Erp57 (proteína RE) en células hES indiferenciadas; Erp57 participa en el plegamiento correcto de la cadena pesada de clase I mientras que TAP-1 y TPN están implicadas en el transporte de péptidos del citosol al RE.

 

Figura 2.- Análisis de RT-PCR (A) y Western-blot (B) de la cadena pesada de MHC-I y algunas
de las proteínas implicadas en la maquinaria del procesamiento antigénico de MHC-I

El efecto de la metilación del ADN en la región promotora algunos de estos genes fue estudiada mediante modificación de bisulfito del ADN genómico y secuenciación. Nosotros observamos que la región 5´ de estos genes esta hypometilada al igual que ocurre en células somáticas diferenciadas como son los linfocitos de sangre periférica (Figura 3). Además, el estado de metilación en estas regiones no varía entre hESC indiferenciadas y cuerpos embrioides, indicando que este mecanismo epigenético no es el responsable de la ausencia de expresión de esos genes en hESC indiferenciadas.

 

Figura 3. (A) Análisis del estado de metilación del gen HLA-B y otras moléculas implicadas en el procesamiento antigénico.Utilizamos el gen HLA-G como control positivo de metilación en hESC. En rojo mostramos la hypometilación y en verde la hypermetilación. (B) Patrón de metilación de la región 5´del gen TAP-1 en hESC, Ebs y PBLs. Los círculos blancos indican las posiciones de las CpGs no metiladas en este caso.

Posteriormente estudiamos otro mecanismo clave en la regulación epigenética como es la modificación de las histonas mediante ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) (Figura 4). Analizamos el estado de metilación de H3-K4 y H3-K9 (tri-metilación) en células hES indiferenciadas y EBs obtenidos a partir de estas. Estas marcas han sido publicadas como marcadores de activación y represión respectivamente en hESC. Estudios preliminares en el gen TAP-1 han mostrado que el nivel de tri-metilación de la H3-K4 fue más alto en EBs que en hESC indiferenciadas, indicando un aumento de la activación de este gen en células diferenciadas regulado por mecanismos epigenéticos. La metilación de H3-K9 en la región bajo estudio del gen TAP-1 fue ligeramente más alta en hESC que en EBs, aunque en general bastante baja en ambos estadios celulares.

 

Figura 4. Análisis de la metilación de histonas mediante ensayo ChIP usando anticuerpos
frente a H3K4 y H3K9 tri-metiladas en hESC indiferenciadas y EBs. NA: no anticuerpo

Discusión

A la vista de los estudios realizados podemos concluir que las hESC muestran una baja expresión de las moléculas de MHC-I en la superficie celular, así como la ausencia de algunas de las moléculas implicadas en la maquinaria de su procesamiento antigénico (TAP-1, TPN, Erp57). Otras moléculas implicadas en el plegamiento correcto de las glicoproteínas (CNX,CLR) muestran niveles normales de expresión. Estudios preliminares, parecen indicar que la expresión de estos genes podría estar regulada por mecanismo epigenéticos como es la metilación de histonas, aunque en principio no observamos metilación del ADN de las regiones bajo estudio. La carencia o pérdida de expresión de las moléculas de MHC-I debida a la baja o ausencia de expresión de algunos de los componentes de la maquinaria de procesamiento antigénico ha sido establecida en tumores como un mecanismo especifico de evasión inmune. Estos resultados abren una vía de estudio centrada en la modificación epigenética de genes asociados al MHC-I en hESC con el objetivo de generar una linea hESC tolerogénica que podría ser donante universal. La utilización de dianas epigenéticas  que eviten la expresión de antígenos MHC de transplante, puede permitir la generación de lineas hES tolerogéncias que puedan diferenciarse en tejidos que no induzcan rechazo inmunológico.

Palabras clave: antígenos de histocompatibilidad linea embrionaria humana tolerogénica dianas epigenéticas donante universal

Bibliografía

  1. Thomson JA et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science .1998;282:1145-1147.
  2. Drukker M, and Benvenisty N. The immunogenecity of Human embryonic stem-derived cells. Trends in Biotechnology 2004;22:136-141.
  3. Li, E. Chromatin modification and epigenetic reprograming in mammalian development. Nat. Rev. Genet 2002, 3:662-673
  4. Shiota K, et al. Epigenetic marks by DNA methylation specific to stem, germ and somatic cells in mice. Genes Cells 2002, 7: 961-969
  5. Lachner M and Jenuwein T. The many faces of histone lysine methylation. Curr Opin. Cell Bio. 2002, 14:286-298.
Autores:

Carlos Lopez-Larrea, Miguel A. Blanco-Gelaz, Cristina Bravo Menéndez, Beatriz Suárez Álvarez.

Número: 5 de 2007