Notas de evaluación

La degradación de la matriz extracelular y de los componentes de la membrana basal son aspectos clave en la invasión tumoral y el desarrollo de metástasis. Algunos componentes de la matriz extracelular, particularmente el colágeno intersticial, son muy resistentes al ataque proteolítico, siendo tan solo degradadas por las metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs). Las MMPs pueden también influir sobre el comportamiento tumoral in vivo en base a su capacidad de estimular el crecimiento tumoral, mecanismos anti-apoptóticos, la motilidad celular o la angiogénesis. Todo ello como consecuencia de su capacidad de activar factores de crecimiento, receptores de la superficie celular, moléculas de adhesión celular o moléculas angiogénicas o, por el contrario, inactivando inhibidores de la angiogénesis o sustancias pro-apoptósicas, conduciendo esto último a la evasión de la muerte celular programada por parte de las células cancerosas. Asimismo, distintas MMPs, tales como la colagenasa intersticial (MMP-1), gelatinasa A (MMP-2), matrilisina-1 (MMP-7), gelatinasa B (MMP-9), estromalisina-3 (MMP-11), colagenasa-3 (MMP-13), y la metaloproteasa de membrana tipo 1 (MMP-14), fueron todas ellas asociadas con parámetros indicativos de agresividad tumoral y/o un pronóstico desfavorable en el cáncer de mama. No obstante, se ha sugerido que la co-expresión de algunas de esas MMPs podría aportar información clínica más acertada sobre el pronóstico del cáncer de mama. Además, existen varios elementos más que  otorgan complejidad al tema. Por una parte, la actividad de las MMPs es específicamente inhibida por sus inhibidores naturales (TIMPs) o por inhibidores no específicos (por ejemplo, a₂-macroglogulina). Hasta la fecha se conocen cuatro diferentes TIMPs (TIMPs 1, 2, 3 y 4). Pero también es sabido que los TIMPs son moléculas multipotenciales, cuyo papel no solo se limita a una inhibición enzimática de las MMPs, sino que también están involucradas en aspectos que, por el contrario, pueden favorecer la progresión tumoral, tales como la inducción de la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis. Por otra parte, también debemos considerar el tipo celular (célula tumoral/célula estromal) que expresa cada factor, ya que ello parece resultar de importancia biológica en la progresión tumoral. Así, por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de MMP-9 por las células estromales, se asocia a una sobre-expresión de HER-2 y predice una corta supervinencia en las pacientes con cáncer de mama, mientras que su expresión en las células cancerosas predice una supervivencia más prolongada.

Todos esos datos sugieren la importancia de considerar nuevas técnicas que nos permitan evaluar una amplia variedad de proteínas, así como el tipo celular que las expresa en el escenario tumoral, de cara a un mejor entendimiento de la compleja biología molecular del cáncer de mama y a una evaluación pronóstica más precisa. La técnica inmunohistoquímica aplicada sobre mallas de tejido ("tissue microarrays") (TMAs) supone una plataforma potencialmente eficiente de cara a evaluar la expresión de muchos factores en una amplia muestra de pacientes, mediante una limitada cantidad de reactivos, y en un corto tiempo de análisis. TMA es una técnica puramente mecánica que implica la toma de cilindros de tejido de múltiples bloques "donadores", y una posterior inserción precisa dentro de un bloque "receptor" previamente vacío, donde las muestras tumorales quedan dispuestas alineadas y perfectamente identificables . Este método, aplicado sobre muestras embebidas en parafina, recientemente nos ha permitido comprobar el interés pronóstico de las expresiones de MMP-1, 2, 7, 9, 11, 13 y 14, y de TIMP-1, 2 y 3, en el cáncer de mama (vizoso et al., 2007; González et al., 2007). Además, en ese estudio nosotros validamos ese método contra la determinación de esos parámetros en la sección tisular completa de los tumores.

Los objetivos de este trabajo han sido:

1. Investigar la expresión de esas diferentes MMPs y TIMPs por los tipos celulares (células tumorales/células estromales) de los carcinomas mamarios.
2. Intentar identificar los diferentes fenotipos de células tumorales o de células estromales asociadas con el desarrollo de metástasis a distancia.

Selección de pacientes

Nosotros seleccionamos pacientes con los siguientes criterios de inclusión: carcinoma invasivo de mama, al menos 10 ganglios examinados histopatológicamente, un periodo mínimo de seguimiento de 5 años en aquellas mujeres que no desarrollaron recurrencia tumoral. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico, haber recibido algún tipo de terapia sistémica neoadyuvante, desarrollo de recurrencia local, y ausencia de suficiente tejido en los bloques de parafina utilizados para realizar los TMAs. De un total de 1053 pacientes cumpliendo esos criterios, seleccionamos aleatoriamente 31 pacientes, de acuerdo a cuatro diferentes grupos de similar tamaño y estratificados con respecto a su status ganglionar y al desarrollo de metástasis a distancia durante el periodo de seguimiento clínico.

Tissue microarrays e inmunohistoquímica

Se elaboraron dos bloques de TMAs y se determinaron, en secciones titulares de los mismos de 5-µm, diferentes MMPs y TIMPs mediante análisis inmunohistoquímico. Para ello se utilizaron anticuerpos específicos contra cada proteína, y un inmunoteñidor automático (Dako). El resultado de las tinciones se evaluó mediante el apoyo de un sistema de análisis de imagen con un microscopio Bx 51 y un programa informático (analySIS®).

Grupo 2

A                                            B                                        C

D                                         E                                         F

Grupo 1                                                                      

Figura 1: 400x. Ejemplos de secciones teñidas con las proteínas más significativas en pacientes pertenecientes al grupo de peor pronóstico (Grupo 2: A,B,C) y al grupo de mejor pronóstico (Grupo 1: D,E,F).A) MMP-11 positiva en células inflamatorias mononucleares, células tumorales y fibroblastos. B) MMP-9 positiva en células inflamatorias mononucleares. Células tumorales y fibroblastos negativos. C) TIMP-1 positivo en células inflamatorias mononucleares y fibroblastos. Células tumorales negativas. D) MMP-9 negativa en los tres tipos celulares. E) MMP-11 positiva en células tumorales. Células inflamatorias mononucleares y fibroblastos negativos. F) TIMP-1 positivo en fibroblastos.  Células inflamatorias mononucleares y células tumorales negativas.

Análisis de los Tissue microarrays

Para cada preparación de anticuerpo estudiada, se determinó la localización de la inmunoreactividad en cada tipo celular, evaluando la expresión de cada factor tanto en la célula tumoral como en las del estroma intratumoral (fibroblastos y células inflamatorias monocitarias). Las inmunotinciones fueron clasificadas en dos categorías dependiendo del porcentaje de células teñidas (casos negativos: 0-10% de células positivas; casos positivos: >10% de células positivas).

Figura 2. Análisis de agrupamiento jerárquico de la expresión global de MMPs/TIMPs en los diferentes tipos celulares del cáncer de mama. A)Células Tumorales B) Fibroblastos C)Células Inflamatorias Mononucleares. La expreseión de las proteínas se refleja en diferentes colores. Rojo:Tinción positiva, verde: tinción negativa, gris: casos perdidos. No se observa agrupamiento de los tumores en el caso de las células tumorales y los fibroblastos, sin embargo 2 grupos mayores (1 y 2) se delimitan en el caso de las células inflamatorias mononucleares.

Análisis de western blot

Los análisis de western blot de MMPs (MMP-1, 11, 13 y 14) de extractos de citosol de cáncer de mama o de placenta humana (utilizada como control) se realizaron como describimos previamente (González et al., Br J Cancer 2007).

A                                                                                                                                                                                                                                                                                      B

Figura 3. A)Western-Blots representativos de MMPs. 80 microgramos de extracto de citosol obtenidos de 7 carcinomas de mama (bandas 2-8) fueron sometidos a 12% SDS-PACE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa y a continuación incubados con antisuero de MMP-1,11,13,14 y b actina (usado como control). Banda 1 marcador de alto peso molecular (50 kDa). B)Western-Blots de MMP-11 y b actina (usado como control) de 2 carcinomas de mama (bandas 1 y 2) y de placenta humana (usado como control positivo, banda 3).

Análisis de datos y métodos estadísticos

Las diferencias en porcentajes fueron evaluadas por el método del chi-cuadrado. Las curvas de supervivencia libre de enfermedad se calcularon mediante el método de Kaplan-Meier, y se compararon con el test de log rank. El modelo de regresión logística múltiple de Cox se utilizó para examinar la interacción entre las diferentes variables pronósticas en un análisis multivariante. Los perfiles de expresión de MMPs y TIMPs fueron analizados mediante un análisis no supervisado de conglomerado jerárquico, que organiza las proteínas en un árbol de tres estructuras, basado sobre sus similitudes. Los datos fueron formateados de la siguiente forma: -3, designados como tinción inmunohistoquímica negativa; 3, tinción positiva; los casos desaparecidos fueron dejados en blanco. Nosotros utilizamos el programa Cluster 3.0. Los resultados fueron expuestos con el programa Treevew (Eisen et al., 1998). El programa SPSS 11.5 fue utilizado para todos los cálculos.

Figura 4. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier en función del agrupamiento jerárquico (Grupos 1 y 2) observado en las células inflamatorias mononucleares.

La Figura 1 muestra ejemplos de tejidos con tinción inmunohistoquímica para los diferentes proteínas. El porcentaje de células positivas para cada proteína fue siempre superior al 50% en los casos positivos para cada tipo celular. Existió una variabilidad con respecto al tipo celular que expresó cada proteína. Para todas las proteínas, la inmunotinción se localizó predominantemente en las células tumorales, pero también en las células estromales en un porcentaje significativo de casos. De cara a identificar grupos específicos de tumores con distintos perfiles de expresión, los datos fueron analizados con análisis de conglomerado jerárquico no supervisado para cada tipo celular. El algoritmo ordena las proteínas sobre el eje horizontal y las muestras sobre el vertical en base a su similitud de sus perfiles de expresión.  Esto no produjo un dendograma con agrupamientos bien definidos de casos para las células tumorales o los fibroblastos Figura 2A y 2B). Sin embargo, para las células mononucleares inflamatorias el dendograma exhibe un primer orden de división de los tumores en dos tipos distintos de perfiles moleculares de MMPs/TIMPs, los designados como grupo 1 (n=89) y grupo 2 (n=42) (Figura 2C). El grupo 2 mostró una elevada expresión de MMP-7, 9, 11, 13 y 14, así como TIMP-1 y 2, en comparación con el grupo 1 (Tabla 1). La presencia de las proteínas fue confirmada por análisis de western blot de muestras citosólicas de los tumores mamarios (Figura 3). Por otra parte, durante el periodo de seguimiento clínico, se confirmó el desarrollo de metástasis a distancia en 41 de 42 (97,6%) pacientes del grupo 2 de tumores y solamente en 24 de 89 (27%) de pacientes del grupo 1 de tumores. El análisis de Kaplan-Meier mostró que la diferencia en supervivencia libre de enfermedad entre esos dos grupos fue alta y estadísticamente significativa (p<0,001; Figura 4). El análisis multivariante demostró que el tamaño tumoral (II: riesgo relativo (RR) (intervalo de confianza (CI)=1,6 (0,8-3,1); III: 3,5 (1,7-7.1); p<0,001) y los receptores estrogénicos (positivos: 0,5 (0,3-0,8), p<0,001) fueron significativamente e independientemente asociados con la supervivencia libre de enfermedad. Sin embargo, ese mismo análisis también demostró que el fenotipo de expresión de MMPs/TIMPs por las células mononucleares inflamatorias del estroma tumoral fue el factor independiente más potentemente asociado con la supervivencia libre de enfermedad (grupo 2: 5,6 (3,5-9,6), p<0,001).

Nosotros identificamos un subtipo de carcinomas mamarios mostrando un fenotipo de células mononucleares inflamatorias que expresan MMPs y TIMPs. Ese grupo supuso un 32% de los carcinomas mamarios, y estuvo notablemente asociado con una elevada tasa de metástasis. Así pues, nuestros resultados demuestran la importancia de las células del estroma tumoral en el comportamiento biológico y clínico del cáncer de mama. Ello sugiere que el estroma tumoral no desempeña un papel meramente pasivo en la progresión del cáncer; sino que, más bien, puede participar activamente en el proceso de invasión tumoral y metástasis. Históricamente, los leucocitos infiltrantes de los tumores han sido considerados como una manifestación de un mecanismo de defensa intrínseco contra el desarrollo de tumores. Sin embargo, nuestros datos están de acuerdo con la creciente evidencia de que la infiltración de leucocitos puede promover fenotipos tumorales, tales como angiogénesis, crecimiento e invasión. La cuestión a resolver es si las células mononucleares inflamatorias que infiltran los tumores responden meramente a señales provenientes de las células cancerosas o responden, en algunos casos, por sí mismas facilitando la expresión tumoral. En todo caso, nuestro hallazgo resulta de gran interés clínico y también sugiere que esas células inflamatorias podrían representar una posible diana terapéutica de cara a la inhibición de la progresión tumoral y las metástasis.