Notas de evaluación

El cáncer de laringe (CL) es el tumor más frecuente en el área de cabeza y cuello y ocupa el sexto lugar entre las neoplasias malignas del sexo masculino. La zona norte de España presenta una de las tasas más altas de incidencia (25 casos/100.000h/año). La mortalidad es paralela a la incidencia con 10 casos/100.000h/año, aunque se ha producido un ligero descenso en el último decenio. La relación cáncer supraglótico/glótico en los países de nuestro entorno se sitúa en 60/40, aunque en los anglosajones esta relación se invierte a favor de los glóticos. El hábito tabáquico se constata en el 95%, siendo excepcional su aparición en los no fumadores. Aunque las técnicas diagnósticas y terapéuticas han avanzado mucho, la supervivencia sigue manteniéndose en torno al 65% a los 5 años, condicionada fundamentalmente por la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos regionales. Es también una observación habitual el desarrollo de segundas neoplasias en la vía aerodigestiva ("teoría del campo de cancerización") y el diagnóstico ocasional de neoplasias intraepiteliales laríngeas (NIL), previas al tumor invasivo.

La diferencia geográfica y de sexo en el CL hace suponer una predisposición genética de la enfermedad, sin que se haya demostrado un patrón hereditario establecido. Se piensa que sobre esta base genética poco definida influyen factores exógenos que provocan cambios genéticos irreversibles, desencadenando la carcinogénesis y la progresión tumoral. Se ha diseñado un modelo de progresión secuencial con LOH (pérdida de heterocigosidad) en el que el acúmulo de cambios genéticos condiciona la expresión fenotípica¹. Básicamente consistiría en:  Mucosa normal (pérdida 9p21 (p16)), Hiperplasia (pérdida 3p21 (FHIT) y 17p13 (p53) NIL bajo grado, (pérdida 11q13, 13q21,14q24) NIL alto grado y (pérdida 6p, 8p,8q,4q26) invasión. Sin embargo, este modelo es incompleto pues sólo contempla pérdidas de material genético y no ganancias y amplificaciones. Además aunque marca bien los pasos precoces es muy deficiente en cuanto al tipo de alteraciones y genes en la fase de invasión y metástasis, que son las que condicionan la supervivencia.

• Describir las alteraciones genéticas (cromosómicas y génicas) en el CL por medio de técnicas citogenéticas: cromosómicas (HGC) y moleculares (MLPA).

• Establecer el patrón metastático de dichas alteraciones.

Sujetos de estudio

56 pacientes con CL intervenidos en el hospital Valle del Nalón entre 1994-2000,  sin haber recibido tratamientos previos. La técnica quirúrgica consistió en la extirpación del tumor primario y el vaciamiento ganglionar. En todos los casos se dispuso de muestras en fresco y parafina del tumor y de la metástasis.

Técnicas citogenéticas y moleculares

En todas las muestras se realizó extracción de ADN  (QIAamp®, QIAgen, Valencia, CA, EEUU).

HGC (hibridación genómica comparativa). Consiste en hibridación competitiva de ADN normal y tumoral marcados con fluorescencia sobre un porta con metafases normales. La relación de fluorescencia verde/roja determina la ganancia o amplificación (>1) con predominio de la señal verde, mientras que la pérdida (<1) se traducirá en un exceso de señal roja. El perfil de la relación de fluorescencia de cada cromosoma se representa sobre un cariotipo denominado idiograma.

       Figura 1.a : Tecnica de la HGC     

MLPA ("multiplex ligation probe amplification"). Es una técnica muy reciente que permite cuantificar en un solo experimento 42 genes diferentes con mínima cantidad de ADN (50 ng), con ventaja sustancial respecto a otras técnicas citogenéticas ². La información de esos 42 genes se obtiene por amplificación PCR de 42 sondas predeterminadas que se cuantifican por electroforesis capilar. Al final se obtiene un patrón de ganancias y pérdidas génicas (Figura 2).  La selección de las sondas depende del tipo de tumor (carcinoma escamoso, adenocarcinoma...) y están comercializadas (MRC-Holland, Amsterdam, Holanda). Una limitación de la MLPA es la ausencia de sondas para nuevas alteraciones génicas, aunque podrían diseñarse  "a la carta".

Variables y estudio estadístico

Las variables clínico-patológicas y las ganancias y pérdidas obtenidas por HGC y MLPA se analizaron estadísticamente mediante el  SPSS 12.0. La asociación de caracteres cualitativos empleó la prueba X² de Pearson y el estadístico exacto de Fisher. Para estimar la supervivencia se utilizaron las curvas Kaplan-Meier, comparando las distribuciones de supervivencia mediante « Log-Rank Test ». El nivel de significación se fijó para una p <0,05.

En el estudio con HGC se obtuvieron múltiples alteraciones en todos los cromosomas (Figura 1b), pero sólo la amplificación 11q13 tuvo relación estadísticamente significativa con la presencia de metástasis ganglionares.

Con MLPA se observaron distintos patrones genéticos en relación con las metástasis ganglionares y supervivencia. Se muestran los estadísticamente significativos en la Tabla I.

el tumor primario, la metástasis ganglionar y algunas variables clínicas.

Tumor 1ºN+: tumor primario metastático. N-: no metastático. Ganglio +: metástasis

Las metástasis ganglionares condicionan la supervivencia en los tumores de laringe y faringe. Por las técnicas citogenéticas se pueden establecer un sello de identidad cromosómico y genético de los tumores con capacidad metastática. La técnica de HGC nos sirve de "screening" para detectar las alteraciones cromosómicas en todo el genoma. La MLPA nos permite identificar alteraciones de 40 genes predeterminados. Los resultados obtenidos por HGC  ya han sido descritos con anterioridad  en laringe y faringe ³ y en otras  localizaciones de cabeza y cuello ⁴, con patrones genéticos diferentes según la extirpe tumoral. Sin embargo los de MLPA son una novedad en el estudio del CL. Ambas técnicas son complementarias, aunque pensamos que la mezcla de sondas de MLPA debería seleccionar los genes  de acuerdo a los hallazgos de HGC. El paso futuro es el diseño de sondas MLPA a la carta, concentrando los genes en puntos concretos de un cromosoma o sobre una vía o ruta metabólica.